相差顯微鏡的原理 使用相差顯微鏡的注意事項

用普通光學(xué)顯微鏡觀察時，難以辨清這樣物體的結(jié)構(gòu)，必須借助于相差顯微鏡，使用固定和染色等理化方法，使樣品和背景的透射光在波長或振幅上發(fā)生變化，即在顏色和亮度上有所差異，以供識別。
生物學(xué)研究經(jīng)常要觀察又薄又透明的樣品，往往使用某種特定染料對細胞染色才可以觀察到，而使用相差顯微鏡則不需要對樣品進行處理就可以直接對細胞進行觀察。相差顯微鏡能觀察到透明樣品的細節(jié)，適用于對活體細胞生活狀態(tài)下的生長、運動、增殖情況及細微結(jié)構(gòu)的觀察。相差顯微鏡是微生物學(xué)、細胞生物學(xué)、細胞和組織培養(yǎng)、細胞工程、雜交瘤技術(shù)等現(xiàn)代生物學(xué)研究的必*工具。
使用相差顯微鏡注意事項：
1、光源要強，相差顯微鏡聚光鏡中的環(huán)狀光闌遮掉大部分光源，所以應(yīng)將視場光闌和孔徑光闌*開啟。
2、采用單色光，為了獲得良好效果，相差顯微鏡應(yīng)使用波長范圍窄的近于單色的光源，相位的變化常因照明光線的波長而不同。通常采用綠色濾光片來調(diào)整光源波長，*好按廠家專用相襯鏡檢的綠色濾光片進行鏡檢。
3、切片要薄，以5~10μm左右為宜，或者更薄，如果樣品過厚，樣品的上層是很清楚的，深層則會模糊不清并且會產(chǎn)生相位移干擾及光的散射干擾，影響相差顯微鏡成象質(zhì)量。
4、載玻長、蓋玻片的厚度應(yīng)符合標準，且不應(yīng)有疵痕，制片的封固劑應(yīng)均勻一致。如果有劃痕，厚薄不均或凹凸不平，則會產(chǎn)生亮環(huán)歪斜及相位干擾。玻片過厚或過薄會使環(huán)狀光闌亮環(huán)變大或變小。相差顯微鏡觀察時要蓋上蓋玻片，否則環(huán)狀光闌的亮環(huán)和相板的暗環(huán)很難重合。
5、物鏡與聚光鏡匹配：注意相差物鏡和聚光鏡里的相差環(huán)要調(diào)成對應(yīng)的。簡單的方法就是物鏡上的Ph標示與聚光鏡上的標示相同，換物鏡時一定要記得把聚光鏡轉(zhuǎn)到對應(yīng)的位置。
6、相位倒轉(zhuǎn)，相差顯微鏡得到象的明暗反差正好相反。當(dāng)相位差δ=0時是無法識別的，隨著δ的增大反差變大，當(dāng)δ繼續(xù)增大到某一值后會出現(xiàn)相位倒轉(zhuǎn)。用90%高吸光值(高反差)物鏡時，這個轉(zhuǎn)變值約為0.55λ，用70%標準吸光值的物鏡時約為0.33λ。較高吸光值的物鏡應(yīng)該用于分辨較小的光程差。
7、暈輪和漸暗效應(yīng)
暈輪：由于相位的延遲而變暗時，并不是光的損失，而是光在象平面上重新分配的結(jié)果，因此在黑暗區(qū)域明顯消失的光會在較暗物體的周圍出現(xiàn)一個明亮的暈輪，當(dāng)環(huán)狀光闌很窄時暈輪現(xiàn)象更為嚴重。
漸暗效應(yīng)：相差觀察相位延遲相同的較大區(qū)域時，該區(qū)域邊緣會出現(xiàn)反差下降。
使用相差顯微鏡效果圖：